Тимберлейк родился в Мемфисе, Теннесси, в семье Линн Харлэсс и Рэндалла Тимберлейка, Джастин имеет английские и индейские корни. Его дед со стороны отца был баптистским священником, и Джастин был воспитан в традициях баптистской веры, считая себя хоть и христианином, но скорее «духовным, чем религиозным». Его родители развелись в 1985 году, затем оба нашли новых супругов. Его мать вышла замуж за банкира Пола Харлэсса, когда Джастину было 5 лет. В это время его отец, дирижер хора в баптистской церкви, также женился.
Первые шаги в музыкальной карьере Джастин сделал на телевизионном шоу «Star Search», исполняя песни в стиле кантри под именем «Justin Randall».
С 1993 г. Джастин выступал в детском шоу «Клуб Микки Мауса», где познакомился с будущим партнером по группе вокалистом Джошуа Чейсезом, а также с Кристиной Агилерой и со своей будущей подружкой — Бритни Спирс. Когда в 1995 году шоу закончилось, Джастин пригласил Чейсеза в новую мужскую музыкальную группу, которая вскоре прославилась как 'N Sync.
Первым кинодебютом Тимберлейка стала роль выдуманной звезды Джейсона Шарпа, который влюбился в официантку. Этот телевизионный фильм назывался «Model Behavior» и транслировался по каналу Disney Channel.
В 1997 Джастин был привлечен в группу 'N Sync. В мае 1998 группа выпустила дебютный альбом, который разошелся более чем 10-миллионным тиражом. Третий студийный альбом 'N Sync No Strings Attached, выпущенный в 2000-м году, продан в количестве около 15 миллионов экземпляров. В том же году группа Тимберлейка получила три награды на церемонии вручения MTV Video Music Awards.
В 2002 году Тимберлейк объявил о своем разрыве с Бритни Спирс и начал сольную карьеру, записав альбом Justified. В следующем году стал главным лауреатом на MTV Europe Awards, а еще год спустя вокруг него разразился грандиозный скандал. Выступая вместе с Джанет Джексон на Super Bowl Half-Time Show перед миллионами телезрителей, он (случайно, по собственному утверждению) оторвал ту часть топа, которая прикрывала правую грудь суперзвезды. По любопытному совпадению, в песне, которую они исполняли, были слова: «Я тебя раздену до конца этой песни».
После этого инцидента Тимберлейк сделал паузу в своей карьере, во время которой он нашел время поработать с рэпперами Snoop Dogg и Nelly. Свой второй альбом — FutureSex/LoveSounds — он записывал вместе с ультрамодным хип-хоп продюсером и автором песен Тимбалэндом. Диск появился на полках музыкальных магазинов в 2006 году и стал одним из самых популярных релизов года.
В начале 2007 года Тимберлейк объявил о разрыве отношений со своей очередной подружкой, Камерон Диаз. В январе на экраны кинотеатров вышел фильм «Альфа Дог», в котором Джастин исполнил одну из главных ролей. Отзывы на игру Тимберлейка были в основном положительными.
